Bir çözelti içerisinde miktarı bilinmeyen bir örneğin UV-Görünür (UV-VIS) bölge absorpsiyon davranışından faydalanılarak miktar tayini yapılır.

Spektroskopide “absorpsiyon”, kimyasal türlerin elektromanyetik ışımanın belirli frekanslarını seçimli olarak azaltması şeklinde tanımlanabilir. Kuantum kuramına göre, her atom, iyon veya molekülün kendine özgü enerji düzeyleri vardır ve bunlardan en düşük enerjili olanına temel enerji düzeyi adı verilir. Boltzmann Dağılım Yasası’na göre, oda sıcaklığında atom, iyon veya moleküllerin büyük çoğunluğu temel düzeyde bulunur. Bu atom, iyon veya moleküller, elektromanyetik ışıma ile etkileştirildiğinde, gönderilen foton enerjisi bunların enerji düzeyleri arasındaki farka eşit ise absorpsiyon olayı gerçekleşir. Böylece atom, iyon veya molekül, uyarılmış enerji düzeyi adı verilen daha büyük enerjili bir düzeyine çıkarılmış olur:

M + hv——– ► M*

Atom, iyon veya molekül bu yüksek enerjili kararsız durumdan, 10″6 ile 10″9 saniye gibi kısa bir süre sonra, ışımalı veya ışımasız olarak iki yolla kurtulabilir:

M*——- ► M + hv

M*——- * M + ısı

Bir molekülün ışığı absorplamasında 3 temel olay gerçekleşir. Her üç olayda da molekül daha yüksek bir enerji düzeyine uyarılır ve molekülün enerjisindeki artış, absorpladığı ışımanın enerjisine eşittir. Bu olaylar, molekülün dönme, titreşim ve elektronik enerji düzeyleri arasındaki geçişleri içerir. Bu geçişlerin bağıl enerj ilerindeki artış, elektronik > titreşim > dönme sırasını izler. Bir molekülün sadece dönme enerji düzeyleri arasındaki geçişleri gerçekleştirmek için elektromanyetik spektrumun mikrodalga bölgesindeki ışımlar kullanılmalıdır. Elektromanyetik ışımanın daha yüksek enerjili infrared bölgesinden seçilen ışımalar ise molekülün dönme enerji düzeylerinin yanı sıra titreşim enerji düzeylerinin de uyarılmasını sağlar. Daha da yüksek enerjili ultraviyole ve görünür bölge ışımasının kullanılması ile dönme ve titreşim enerji düzeyleri arasındaki geçişlerle beraber elektronik geçişler de gerçekleşir. Elektronik geçişlerin nedeni, ışımanın moleküldeki bazı fonksiyonel gruplar tarafından absorblanmasıdır.

Bir moleküldeki elektronlar dört değişik türde düşünülebilir. (1) Bağlanmaya katılmayan dolu kabuk elektronları. Bunların uyarılma enerjileri çok yüksektir ve görünür veya UV bölge absorpsiyonuna katkıları yoktur. (2) kovalent tekli bağ elektronları (sigma, a elektronları) Bunların da uyarılmaları için daha yüksek enerjili ışıma gereklidir. (3) Çiftleşmiş, bağ yapmayan dış kabuk elektronları (n elektronları). Bunlar sigma elektronlarına oranla daha gevşek bağlanmış olduklarından UV veya görünür bölge ışıması ile uyarılabilirler. (4) İkili ve üçlü bağlarda bulunan % orbitali elektronları. Uyarılmaları çok kolay olan bu elektronlar, UV ve görünür bölgede gözlenen geçişlerin büyük bir çoğunluğundan sorumludurlar.

Bir molekülde absorpsiyon yapan gruba kromofor adı verilir. Kendisi ışığı absorplamadığı halde, absorpsiyonun şiddetini ve dalgaboyunu değiştiren gruplara ise okzokrom adı verilir. Bir absorpsiyon spektrumunda absorpsiyon maksimumunun daha uzun dalgaboyuna kaymasına batokromik kayma, daha kısa dalgaboyuna kaymasına hipsokromik kayma; absorpsiypn şiddetinin artmasına hiperkromizm azalmasına ise hipokromizm adı verilir. Tablo 2’de bazı kromoforların maksimum absorpsiyon dalgaboyları ile molar absorpsiyon katsayıları görülmektedir.

Kromofor Sistem À’max (nm) Emax (L/cm mol) Emax (L/cm mol)
Amin -NH2 195 2800
Etilen -OC- 190 8000
Keton >c=o 195 1000 270-285 18-30
Aldehit -CHO 210 Kuvvetli 280-300 11-18
Nitro -N02 210 Kuvvetli
Nitrit -ONO 220-230 1000-2000 300-400 10
Azo -N=N- 285-400 3-25
Benzen 184 46700 202 6900
Naftalin 220 112000 275 5600
Antrasen 252 199000 375 790

Şekilde şematik olarak gösterilen bir spektrofotometrenin temel bileşenleri: (1) ilgilenilen dalgaboyu aralığında ışıma yapabilen bir ışık kaynağı, (2) istenilen dalgaboyu bandını, lambanın sürekli spektrumundan ayıran bir monokromatör, (3) ışıma enerjisini elektrik enerjisine çeviren dedektör ve (4) dedektörden çıkan sinyali kaydetmek için kullanılan bir kaydedicidir.

Görünür bölgede en yaygın olarak kullanılan ışık kaynağı tungsten flaman lambasıdır. 350-3000 nm arası gibi çok geniş bir aralıkta ışıma yapabilen bu lamba, yakın UV ve infrared bölgelerinde de kullanılabilir. Ultraviyole bölgede ise, 185-375 nm arasında ışıma yapabilen düşük basınçlı hidrojen ve döteryum boşalım lambaları kullanılır. Bu bölgede kullanılan ışık kaynağı pencerelerinin kuartz olması gerekir, çünkü cam UV ışımayı geçirmez.

Bir monokromatörün ışımayı odaklamak için mercek ve aynaları, istenmeyen ışımanın engellenmesi için giriş ve çıkış aralıkları ve kaynaktan gelen polikromatik ışımadan istenilen dalgaboylarını seçmek için bir ayırma ortamı bulunmalıdır. Ayırma ortamı olarak prizmalar ve optik ağlar kullanılır. Elektromanyetik ışıma, bir prizmadan geçtiğinde prizmanın kırılma indisinin havanın kırılma indisinden farklı olması nedeniyle kırılmaya uğrar. Kırılma indisi dalgaboyu ile değiştiği için, polikromatik ışıma prizma içinden geçtiğinde kısa dalgaboylu ışımalar uzun dalgaboylu ışımalara oranla daha fazla kırılmaya uğrarlar. Prizmalar tüm UV ve görünür bölge dalgaboyu aralığında kullanılabilirler fakat ayırma güçleri dalgaboyu ile değişir, kısa dalgaboylarında daha etkindirler.

Görünür bölgede cam prizma ve mercekler kullanılırken, UV bölgede kuartz prizma ve mercekler kullanılmalıdır. Optik ağlar, şekilde görüldüğü gibi üzerinde çok sayıda ve eşit uzaklıklarda ince aralıklar veya çıkıntılar bulunan alüminyum gibi parlatılmış yüzeylerdir. 1 cm’de yaklaşık 6000-12000 arasında değişen aralık veya çıkıntı ile etkileşen ışık, ışımanın difraksiyonu (kırınımı) ilkesine göre dalgaboylarına ayrılır. Optik ağların ayırma gücü, içerdiği aralık veya çıkıntı sayısı gittikçe artar. Genel olarak, optik ağların ayırma gücü prizmalara oranla daha büyüktür ve dalgaboyu ile değişim göstermez.

Amino asidlerden halkaya sahip olan triptofan, tirozin ve fenilalaninden ileri gelen 280 nm’deki karakteristik absorbans değerlerinden yararlanarak proteinler kantitatif olarak tayin edilebilirler.

KAYNAKLAR

http://www.protein.ege.edu.tr/Konular/Protein%20tay.pdf

www.kimyamuhendisi.com/

http://scholar.google.com

en.wikipedi.org

www.scribd.com