Proteinlerin Elektroforetik Saflaştırılması – 6

Poliakrilamid Jel Elektroforezi (PAGE)

Akrilamid monomerlerden polimerlerin sentezi sonrası jel elektroforezinde yeni çığırlar açılmıştır. Poliakrilamid jel elektroforezi (PAGE) ile serum proteinlerini 20’den fazla parçaya ayırmak olası olmuştur.

Poliakrilamidin gözenekliliği, akrilamid konsantrasyonu değiştirilerek kolaylıkla düzenlenir. PAGE ile proteinlere herhangi bir işlem uygulanmadan sahip oldukları elektriksel yüke göre ayrım sağlanabilirken sodyum dodesil sülfat (SDS)  ile muamele edilerek elektroforezde ayrım yapılırsa proteinlerin molekül büyüklüğüne göre ayrılması sağlanır. Proteinlerin elektroforetik olarak saflaştırılmasında en yaygın kullanılan elektroforez tekniğidir. 

PAGE, farklı şekillerde sınıflandırılabilir:

Jelin Biçimine Göre

Jelin Konumuna Göre

Jelin Bileşimine Göre

Jelin Gözenek Dağılımına Göre

Jelin Türüne Göre

Tüp JE

Dikey JE

Doğal JE

Homojen JE

Devamlı JE

Tabaka JE

Yatay JE

SDS’li JE

Dereceli JE

Kesikli JE

1. Jelin Biçimine Göre

1.1. Tüp Jel Elektroforezi

1.2. Tabaka Jel Elektroforezi

2. Jelin Konumuna Göre

2.1. Dikey Jel Elektroforezi

2.2. Yatay Jel Elektroforezi

3. Jelin Bileşimine Göre

3.1. Doğal Jel Elektroforezi

3.2. SDS’li Jel Elektroforezi

SDS ve PAGE
SDS ve PAGE

SDS’li elektroforezde örnek hazırlama tamponuna bir miktar SDS eklenir. SDS, örnekteki protein moleküllerinin etrafında boşluk kalmayacak şekilde bir katman oluşturur. Sonuçta, her molekül, homojen bir şekilde (-) yükle kaplanmış olur. Sonuçta proteinlerin ayrışması, moleküllerin kendi yükünden bağımsız olacağından, doğrudan doğruya molekül ağırlıklarına göre olur. Bu yöntem daha çok proteinlerin molekül ağırlıklarının saptanmasında kullanılır. Yine, küresel proteinler ısıtılıp dördüncül yapıları bozularak monomerlerinin ayrıştırılmasında kullanılabilir.

SDS-PAGE
SDS-PAGE

4. Jelin Gözenek Dağılımına Göre

4.1. Homojen Jel Elektroforezi

Bu elektroforezde, akımın uygulandığı iki elektrot arasındaki mesafe boyunca jel konsantrasyonu sabittir. Dolayısıyla, gözenek çapı homojendir.

4.2. Dereceli Jel Elektroforezi

İki elektrot arasında jel konsantrasyonu giderek artar, gözenek çapı da giderek küçülür. Başlangıçtaki büyük gözeneklerden tüm moleküller geçerken gittikçe geçirgenlik azalır. Böylece moleküller, kendi büyüklüklerine uyan gözeneklerde takılarak molekül ağırlıklarına göre ayrışırlar. Jel konsantrasyonunda aynı gradyenti sağlamak zor olduğundan tekrarlanabilirliği düşüktür.

5. Jelin Türüne Göre

5.1. Devamlı Jel Elektroforezi 

Aynı konsantrasyon ve pH’da jel hazırlanır.

5.2. Kesikli Jel Elektroforezi

Farklı konsantrasyon ve pH’da jel bölgeleri hazırlanarak yapılır. Genellikle bir istifleyici, bir ayırıcı jel olmak üzere iki aşamalı olarak uygulanır. 

PAGE; serum proteinlerinin, proteinlerin genetik varyasyonlarının ve izozimlerin analizinde en iyi sonuç veren elektroforez çeşitidir. En önemli avantajı, jel konsantrasyonunun kesin olarak belirlenip değiştirilebilmesi ve böylece gözenek büyüklüğünün istenen şekilde saptanmasına olanak vermesidir. Jel konsantrasyonunun artırılması, gözenek çaplarının küçülmesiyle sonuçlanır. Böylece jel, bir moleküler elek görevi yaparak ayrıştırmayı sağlar.

Prosedür

Örnek Hazırlama

Hücrelerin içerdiği proteinlerin analizi yapılacak ise öncelikle çeşitli yöntemler ile hücre zarı parçalanır. Proteinlerin dokulardan ya da hücrelerden alınması durumunda elektroforez öncesi filtrasyon ve santrifüj gibi çeşitli yöntemler ile hücre bileşenleri ve organelleri ayrılır.

Analiz edilecek örnek SDS ile (proteinlerin ikincil yapılarını ve disülfit olmayan diğer bağlar ile oluşan dördüncül yapılarını denatüre eden anyonik deterjan) karıştırılır. Böylece proteinlerin etrafı negatif yük ile kaplanmış olur. Örnekleri en az 60°C ye kadar ısıtmak proteinlerin daha iyi bir şekilde denatüre olmasını ve böylece SDS moleküllerinin protein moleküllerine daha kolay bağlanmasını sağlar.

Protein çözeltisine takip boyası (brom fenol blue) da eklenebilir. Bu tip boyalar proteinlerden daha yüksek elektroforetik hareketliliğe sahiptir. Böylece elektroforetik yürütme süresince proteinlerin hareketi izlenerek jelin dışına çıkması engellenir.

SDS ile birlikte konulan diğer kimyasallar: 1.5 M Tris.HCl (pH 8.8), Distile su, Gliserol, β-Merkaptoetanol.

SDS PAGE – Örnek Hazırlama

Ayırma Jeli

1.5 M Tris.HCl (pH 8.8); Distile su; % 10’luk SDS; % 30’luk akrilamid; % 0.8’lik bisakrilamid; N,N,N’,N’-tetrametiletilendiamin (TEMED); % 10’luk Amonyum persülfat (APS).

Yükleme Jeli

0.5 M Tris.HCl (pH 6.8); Distile su; % 10’luk SDS; % 30’luk  akrilamid; % 0.8’lik bisakrilamid; N,N,N’,N’-tetrametiletilendiamin (TEMED); % 10’luk Amonyum persülfat (APS).

SDS-PAGE – Ayırma/Yükleme Jellerinin Hazırlanışı
Akrilamid Polimerizasyonu
Akrilamid Polimerizasyonu

Jel gözenek büyüklüğü iki faktörden etkilenir: Akrilamid konsantrasyonu, Çapraz bağlayıcı konsantrasyonu.

Çağraz bağlayıcının sabit olduğu durumlarda jeldeki akrilamid konsantrasyonu gözenekliliği belirler. Eğer jel % 7’lik ise molekül ağırlığı 50 kDa ile 500 kDa arası; % 10’luk ise 20 kDa ile 300 kDa arası; %12’lik ise 10 kDa ile 200 kDa arası; %15’lik ise 3 kDa ile 100 kDa arası proteinlerin ayrımı gerçekleştirilir.

Hazırlanan ayırma jeli cam plakalar arasına yukarıdan yaklaşık 2 cm boşluk (yükleme jeli için) olacak şekilde dökülür. Polimerleşmeden önce jelin üst kısmının düz olması için suya doygun bütanol (şekilde izopropanol) ilave edilir. Polimerleşmenin tamamıyla gerçekleşmesi için yaklaşık 30 dakika beklenilir. Polimerleşme sonrası suya doygun bütanol uzaklaştırılır. Bundan sonra yükleme jeli hazırlanır.

Hazırlanan yükleme jeli ayırma jelinin üzerine dökülür. Örneklerin jele kolay yüklenebilmesi için jelde kuyucuklar hazırlanır. Yükleme jeli döküldükten sonra kuyucukların oluşması için tarak konulur. Böylece yaklaşık 30 dakika beklenilir. Polimerizasyonun gerçekleştiğinden emin olduktan sonra dikkatli bir şekilde tarak çıkarılır. Ve oluşan kuyucuklara otomatik pipet yardımıyla önceden hazırlanmış örnekler yüklenir.

SDS-PAGE Akrilamid Jel
Jellerin Dökümü

Hazırlanan jel, içerisi yürütme tamponu ile dolu olan elektroforez tankına yerleştirilir ve akım uygulanarak (150-180 V) elektroforez işlemi başlatılır.

SDS-PAGE – Elektroforez Tankı-Yürütme

Yürütme tamponu: 0.025 M Tris (pH 8.3), 0.2 M Glisin, % 0.1’lik SDS (w/v). Yürütme tamponları anot ve katot için farklı olduğu gibi aynı da olabilir.

SDS-PAGE – Yürütme Tamponları

Daha sonra fiksasyon (sabitleme) ve boyama işlemleri var. Ancak şimdilik bunları anlatmayacağız. Talep olursa cevap verilebilir.

Kullanılan Kimyasallar ve Üstlendikleri Görevler

Kimyasal Tampon: Jelde ve elektroforez tankında pH değerinin belirli değerde olmasını sağlar. Tampon çözelti reaksiyona girmemeli ve proteinleri modifiye etmemeli. SDS-PAGE de kullanılan yaygın tamponlar şunlardır: Tris, Bis-Tris, İmidazol.

Akrilamid (C3H5NO; MW: 71.08): Jel polimerinin monomeri. Serbest radikal polimerizasyonu ile polimerize olur. Polimerleşme oldukça polimer viskoz hal alır fakat jelleşmez. Jelleşme olması için polimer zincirler arası bağ olması gerekir. Akrilamid nörotoksik maddedir. Akrilamitin kendiliğinden polimerizasyonunu ve hidrolizini önlemek için akrilamid serin-karanlık ve kuru ortamda tutulmalıdır.

Bisakrilamid (N,N’-Metilenbisakrilamid) (C7H10N2O2; MW: 154.17): Çapraz bağlayıcı ajan. Jelleşmeyi sağlar.

Sodyum dodesil sülfat (SDS) (C12H25NaO4S; MW: 288.38): Proteinleri, özellikle polipeptitleri denatüre ederek üç boyutlu yapılarını bozar ve böylece protein doğrusal hale gelir.

SDS ve Protein
SDS ve Protein

Amonyum Persülfat (APS) (N2H8S2O8; MW: 228.2): Serbest radikal kaynağıdır. Jel oluşumunu başlatır.

Poliakrilamit Jel Üretiminde Kullanılan Bazı Kimyasallar
Poliakrilamit Jel Üretiminde Kullanılan Bazı Kimyasallar

TEMED (N,N,N’,N’-tetrametiletilendiamin) (C6H16N2; MW: 116.21): Serbest radikalleri kararlı hale getirir ve polimerizasyonu katalizler. APS ve TEMED genellikle aynı miktarlarda kullanılır.

Gliserol: Örneklere yoğunluk verir.

β- Merkapto etanol (BME): Denatürasyona yardımcıdır. Disülfit bağlarını kırar.

Görüntülemede Kullanılan Kimyasallar

Takip boyası: Bromfenol mavisi (BPB, 3′,3”,5′,5” tetrabromofenol sülfonaftalein).

Coomassie Brilliant Blue R-250 (CBB) (C45H44N3NaO7S2; MW: 825.9): En popüler protein boyası.

Kaynaklar

Lütfen Login yada Register gizli linkleri görebilmek için

Rıdvan

Yıldız Teknik Üniversitesi’nde Doktora yapmakta.

Proteinlerin Elektroforetik Saflaştırılması – 6” için bir yorum

  • 23 Kasım 2016 tarihinde, saat 14:10
    Permalink

    Valla cok teşekkür ederim…en cok hosuma giden sey neden icerisinde gliserol var? Neden sds var gibi sorularima duygularima tercuman olmanız oh be ogrenmek cok guzel birşey

    Yanıtla

Bir Cevap Yazın

E-posta hesabınız yayımlanmayacak. Gerekli alanlar * ile işaretlenmişlerdir

Göztepe Escort