HPLC (Yüksek Basınç Sıvı Kromatografisi)

HPLC (Yüksek Performans-Basınç Sıvı Kromatografisi)

1970’lerden günümüze, HPLC tekniği, laboratuarlarda organik maddeler için ayırma, analiz ve saflaştırmanın vazgeçilmez seçeneği olmuştur. HPLC kolonu neredeyse çözünemeyen tüm karışımları ayırabilir.
Yüksek performans sıvı kromatografisi (HPLC) günümüzde geniş çaplı molekül analiz ve saflaştırmalarında öncü teknik olarak tam yer edinmiştir. HPLC özellikle de peptit ve proteinlerin karakterizasyonunda merkezi teknik olmuş ve biyolojik ve biyomedikal bilimlerde son on yıldır çok hızlı sağlanan ilerlemede kritik roller üstlenmiştir .

Güçlü bir ayırma yöntemi birbirine benzer analitlerin çokça bulunduğu karışımları dahi çözebilmelidir. HPLC tekniğinin gücünü, 8 farklı benzodiazepin molekülünü 70 saniye içerisinde analiz etmesi göstermektedir. Kromatogram hem nicel hem nitelik bilgisi verir, karışımdaki her bileşenin çıkış zamanı ayrıdır. Bu örnekten HPLC’nin ne kadar verimli olduğunu ve kısa sürede mükemmel ayrımlar yapabildiğini anlamak mümkündür. Modern kromatografi tekniğini geliştiren Martin ve Synge 1941 yılında, hareketli fazın kolon boyunca yüksek basınçla itilmesi gerekliliğini düşünmüşlerdir. Buradan hareketle HPLC’ye bazen de yüksek basınç sıvı kromatografisi denilmektedir.

hplc kromatogramı

Kromatografinin Seçimi
HPLC’nin büyük başarısını sağlayan, yenilenebilirlik, seçici manipülasyon yapma kolaylığı ve genelde yüksek saflaştırma yetenekleridir. En mükemmel özelliği birbirine çok benzeyen ya da farklı moleküller için bile belirli şartlar altında sağladığı olağanüstü çözünürlüğüdür. Bu üstünlük, tüm etkileşimli kromatografik tekniklerin, kromatografinin özelliğine özgünlük gösteren elüsyon koşullarıyla düzenlenebilen tanıma kuvvetlerine bağlı olmasından gelir. Peptit ve proteinler kromatografik yüzeyle yöne özgül davranışlar gösterir, bunların gecikme süresi özgün bağlanma alanlarının yoğunluğuyla belirlenir. İkincil ve üçüncül yapıyı gösteren büyük proteinler için kromatografik temas alanları toplam molekülün çok küçük bir kısmıdır. Bu nedenle peptit ya da proteinin, özel sabit faz yüzeyinde özgün yönelme yapması, HPLC sayesinde çok seçici hale getirilebilir. Tüm biyolojik süreçler moleküller arasındaki özgün etkileşimlere dayanır ve affinite kromatografisi bu özgün etkileşimleri kullanarak molekülü saflaştırmayı sağlar. Ters faz HPLC’nin aksine, iyon değişim ve hidrofobik etkileşim kromatografileri peptit ve proteinleri yüzey yük ve hidrofobiklik farkına göre ayırır. Bu teknikler karmaşık karışımlarında ayrılmasını sağlarken affinite kromatografisi bir ya da az sayıdaki birbirine benzer bileşenli karışımları ayırabilir.
HPLC pek çok farklı biyolojik kaynaktan peptit ve proteinlerin izolasyonu için çok yetenekli bir araçtır. HPLC ile yapılan peptit ve protein saflaştırma çalışmaları çok hızlı bir şekilde artmaktadır. Katı faz peptit sentezi (SPSS) ve rekombinant DNA tekniklerinin gelişmesiyle saflaştırmaya olan ihtiyaç artmıştır. Kromatografiye verilecek karışımın karmaşıklığı, elde edildiği kaynağın doğasına ve elde ediliş sırasındaki kirlilik giderimine bağlıdır. Sentetik peptitler için RPC (ters faz kromatografisi) genelde analizin ilk aşamalarında ve son olarak büyük çaplı saflaştırmada kullanılır. Biyolojik örneklerden elde edilen proteinler ise daha homojen örnekler kazanmak için başka tekniklerin yardımını gerektirir.
Ters faz kromatografisi (RPC), iyon değiştirici kromatografi (IEC) ve boyut dışlama kromatografisiyle (SEC) beraber peptitlerin ayrımında en fazla kullanılan tekniktir. RPC tekniğinde üç boyutlu protein yapıları sağlanan şartlar altında bozulabilir bu nedenlerde RPC ile işlevi korunmak istenen proteinler saflaştırılmaz. Burada devreye IEC, SEC ve affinite kromatografileri girmektedir.
Boyut dışlama (Size Exclusion) HPLC
Sıvı kromatografisi, boyut dışlama HPLC genellikle peptit/protein ayırımları ve moleküler ağırlık analizleri için kullanılır. Denaturant varlığı veya yokluğunda, üçüncül veya dördüncül yapılar moleküler ağırlığı analizleriyle gösterilebilir. Bazı uygulamalar ideal SEC davranışlarını gerektirir, ayırımlar sadece çözelti boyutuna dayanır. Ama en yeni HP SEC kolonları, uzun ya da kısa boyutlarda ve anyoniktir. İstenmeyen elektrostatik etkileşimler engellenmezse, bazı özellikler, artı yüklü peptit yan zincirleriyle etkileşimlere neden olur. Elüentin iyonik gücünün üstünde, elektrostatik etkiler en aza indirildiği için, 0.1-0.4 M tuz içeren sıvı fosfat tamponları (ph 5.0-7.5) SEC ile peptit ve protein analizinde hareketli faz olarak kullanılır. Elektrostatik etkileşimler baskın etken olduğunda tuz konsantrasyonları çok yüksek ise, peptit-protein veya protein-protein etkileşimleri engellenir. Farklı kolon materyalleri istenilmeyen kolon davranışlarının görülmesine neden olabilir.
İyon Değiştirme (Ion Exchange) HPLC

İyon Değiştiriciler
İyon Değiştiriciler

İster anyon ister katyon değiştirici olsun; tamponun pH’ı, kullanılan anyon veya katyon değiştiricinin doğal iyonik gücü ve peptitlerin yükü proteinlerin gecikme zamanlarını etkiler. En yaygın olarak sodyum veya potasyum iyonları katyon olarak, klor iyonları da anyon olarak kullanılır. HP IEC kolonları yüksek derecede pik genişlemesi veya elüsyon olmama durumu gösteren, peptitlerin apolar kalıntılarının neden olduğu hidrofobik karakteristikler gösterirler. Bu durum hareketli faza organik düzenleyici konulmasıyla giderilebilir.

Ters Faz (Reverse Phase) HPLC

Ters faz kromatografisi (RPC) en yaygın sıvı kromatografisi haline gelmiştir. Burada sabit faz apolar, hareketli faz polardır. Analitler yüzeye apolar fonksiyon gösteren gruplarıyla bağlanırlar. En polar analit kolondan ilk önce çıkar. RP kromatografisi orta-yüksek polarlığa sahip analitler için gayet kullanışlıdır.
Ters faz ayırma tekniği, örnek ile apolar bağlanma fazı ve polar sabit faz arasında basit ayrılma olmasına dayanır. En polar örnek bileşenleri, apolar bileşiklerin apolar kolon paketiyle gecikmesine dayalı olarak en önce gelmelidir. Fakat pratikte bu kadar olmaz. En ileri “end-capped” kolonlarda bile altta bulunan anyonik silika işe karışır ve ayırmayı etkiler. Polimer temelli kolonlarla karşılaştırıldığında diğer kolonların ulaşamayacağı ayırımları yapan kolona bu özelliğini silika verir. Silika ters faz kolonu yaşlandıkça daha çok silika bölgesinin hidrolizle serbest kalmasından dolayı, koşma karakteristikleri değişir.

HPLC Dezavantajları

Pek çok analizde, istenilen bileşikler bir karışımın bir parçası olarak bulunurlar ve kromatografik tekniklerin bu noktada ayırma işlemleri için devreye girmesiyle nicel analizler veya tanılama mümkün olmaktadır. Kromatografinin bu konudaki yetersizliği, bileşikler tamamen birbirlerinden ayrılsa bile açık ve anlaşılır şekilde bir tanılama sağlayamamasıdır. Tanılama, sağlanmış deney koşullarında referans malzemelerinin alıkoyma karakteristikleriyle yapılır. Fakat bu noktada analist hiçbir zaman aynı alıkoyma zamanına sahip iki bileşiğin aynı madde olduğuna tam emin olamaz. Her ne kadar analistin elinde ayarlayabileceği pek çok kromatografik koşul da olsa, karışımın tüm bileşenlerini tamamen ayırmak mümkün olmaz ve bu durum istenilen analitin tam ve doğru nicel analizini engeller.

 Sitedeki İlgili Diğer Yazılar

 Kromatografik Yöntemler

HPLC

Kaynaklar
Lütfen Login yada Register gizli linkleri görebilmek için

 Videolar 

Kısa Tanıtım ve Enjeksiyon

HPLC Cihazı

HPLC (içlerinde en kalitelisi bu bence)

Bir Cevap Yazın

E-posta hesabınız yayımlanmayacak. Gerekli alanlar * ile işaretlenmişlerdir