Protein Saflaştırmada Çöktürme Yöntemleri

PROTEİN SAFLAŞTIRMADA ÇÖKTÜRME YÖNTEMİ

İlgili proteinin diğer proteinlerden ayrılmasında veya proteinlerin deriştirilmesinde kullanılan çöktürme işlemi, proteinleri saflaştırma işlemlerinin çoğunda kullanılmaktadır. Araştırmanın amacına uygun olarak proteinleri çöktürme işlemi santrifüjleme ve filtrasyonla elde edilen fraksiyonda veya doğrudan fermantasyon ortamında yapılabilir.

Protein molekülünün yüzeyindeki hidrofilik ve hidrofobik grupların dağılımı proteinlerin çeşitli çözücülerdeki çözünürlüğünü etkiler. Proteinlerin bu özelliklerinden yararlanılarak amaca uygun olarak farklı şekillerde çöktürme işlemleri yapılır. Bunlar pH, ısı, organik çözücüler, organik polimerler ve yüksek tuz derişiklerinde çöktürme işlemleridir. Bu çöktürme işlemlerinden en çok tercih edilen yüksek tuz derişikleri ile çöktürmedir.

1. Tuz ile Çöktürme

Proteinlerin su içerisindeki çözünürlükleri çok azdır. Ortama bir miktar nötral tuz (NaCl ve (NH₄)₂SO₄ gibi) ilave edildiğinde proteinleri yüzeyinde veya iç kısımlarında bulunan hidrofobik grupların su ile etkileşim derecesi artar, bu durumda proteinlerin çözünürlükleri de artar. Bu olaya salting in denir. Protein çözeltisine çok miktarda nötral tuz ilave edildiğinde, proteinlerin genellikle iç kısımlarında yer alan hidrofobik gruplar etrafındaki su molekülleri tuz iyonları tarafından uzaklaştırılır, bu durumda hidrofobik grupların birbirleri ile olan etkileşimleri artar ve proteinler çökerler. Bu olaya ise salting out denir.

Protein çözeltisinde hidrofobik alanları büyük ve daha fazla olan proteinler, hidrofobik alanları küçük ve daha az olanlarınkine göre daha çabuk birbirleri ile etkileşerek çökerler. Bu olaya proteinlerin fraksiyonlanması denir. Bu işlem için protein çözeltisine farklı derişimlerde amonyum sülfat eklenir, oluşan çökelti santrifüjleme ile geri elde edilir ve uygun bir tamponda tekrar çözülür. Her çözeltide ilgili protein, analiz yöntemleriyle aranır. Bu şekilde ilgili proteinin bulunduğu çökelti fraksiyonu, diğer protein fraksiyonlarından uzaklaştırılmış olunur. Böylece çöktürme işlemi ile kısmi bir saflaştırma yapılmış olunur.

Çöktürme işlemi aynı zamanda çok seyreltik olan protein çözeltilerinin deriştirilmesinde kullanılabilir. Bu işlem için çok seyreltik olan protein çözeltisine yüksek derişimlerde amonyum sülfat eklenir, daha sonra santrifüjleme ile elde edilen çökelti uygun bir hacimde tamponda çözündürülür.

Çöktürme işleminde birçok avantajı nedeniyle en fazla kullanılan tuz amonyum sülfattır. Amonyum sülfat proteinleri denatürasyon, proteolizis ve bakteriyel kontaminasyona karşı kararlığını korur. Ayrıca, amonyum sülfatın çözünürlüğü çok az değişir (0-30˚C) ve büyük miktarlarda ucuz bir şekilde saf olarak elde edilebilir.

2. Tuzların Uzaklaştırılması

Tamponda çözündürülmüş çökeltideki tuzlar veya amaca göre tampon bir sonraki saflaştırma adımını etkilememesi için diyaliz veya jel filtrasyon tekniği ile uzaklaştırılır veya değiştirilebilir.

2.1. Diyaliz

Protein çözeltilerindeki tuzların uzaklaştırılmasında veya çözelti tamponunun değiştirilmesinde çoğunlukla diyaliz işlemi uygulanır. Bu işlem için özel imal edilmiş, genellikle selüloz asetattan yapılmış, gözenekli ve küçük molekülleri geçiren ancak büyük molekülleri geçirmeyen yarı geçirgen bir membrandan oluşan diyaliz torbası kullanılır. Protein çözeltisi bu diyaliz torbasına konur ve uygun bir tampon içerisine bırakılır. Çok yavaş bir şekilde karıştırılır. Küçük moleküller membrandaki osmotik basınç dengelene kadar serbestçe membrandan geçerler. Dengeye ulaştığında moleküllerin dış tampona geçmesi durur. Bu nedenle membran içerisindeki tuz veya tamponu tamamen uzaklaştırmak için, membran dışındaki tamponu ya birkaç kez değiştirmek gerekir ya da peristaltik bir pompaya bağlanan özel bir düzenekle sürekli değiştirilir. Protein aktivitesindeki kaybı en aza indirebilmek için, diyaliz genellikle +4˚C’de gece boyunca (yaklaşık olarak 16-18 saat) yapılır. Diyaliz esnasında bazı enzimlerin aktivitesi için gerekli olan koenzimler veya kofaktörler diyalizle ayrılabilir. Bu durumda ilgili enzim aktivitesi düşük veya hiç görülmeyebilir. Bu nedenle diyaliz sonrası ilgili enzimin koenzim veya kofaktörü tampona eklenmelidir.

Şekil . Diyaliz

2.2. Jel Filtrasyonu

Bu yöntem tuzların uzaklaştırılması ve tampon değiştirilmesinde diyalize göre daha hızlı olmasına rağmen, küçük hacimlerde uygulama yapılması ve işlem sona erdiğinde oldukça seyreltik bir protein çözeltisi elde edilmesi nedeniyle dezavantajlıdır. Bu işlem için genellikle Sephadex^® G25 veya BioGel^® P-6 gibi küçük gözenekli jel filtrasyon matriksleri kullanılır. Bu matriksler özel işlemlerle şişirildikten sonra uygun bir kolona doldurulur. Amaca göre istenilen tampon ile birkaç kez yıkanarak dengeye getirilir. İlgili proteinin bulunduğu çözelti kolona yüklenir ve dengeye getirilen tampon ile yıkanır. Proteinler ve diğer yüksek molekül ağırlıklı moleküller (> 6000) kolonu ilk önce terk ederken, düşük molekül ağırlıklı moleküller kolon tarafından alıkonarak, kolonu çok yavaş terk ederler. Böylece proteinler tuzlardan uzaklaştırılmış ve tamponda değiştirilmiş olunur.

 

Şekil . Jel filtrasyonu (Sephadex G-25) ile tuzun uzaklaştırılması

3. pH Değişimi ile (İzoelektirk) Çöktürme

Çözeltinin pH değerini proteinin izoelektrik noktasına (pI) yakın ya da eşit duruma getirmektir. Bu işleme izoelektrik çöktürme denir. Bu yöntemde çözeltinin pH değeri proteinin izoelektrik noktasına yakın ya da eşit duruma getirilir. Protein moleküllerinin yüzeyi negatif ve pozitif yüklü gruplar ile kaplıdır. pI değerinin üstünde yüzey negatif yüklüdür. pI değerinin altında ise yüzey pozitif yüklüdür. Bu nedenle bu noktalarda yükler birbirini iterler. İzoelektrik noktada ise protein yüzeyindeki negatif ve pozitif yükler birbirlerine eşit olur ve moleküller arasında elektrostatik çekim oluşur ve benzer moleküller arasında artık elektrostatik itmeler oluşmayacaktır. Bu da proteinlerin çökmesine neden olur.

İzoelektrik çöktürme genellikle istenen proteinden çok istenmeyen proteinleri çöktürmek için kullanılır, çünkü çöktürme sırasında denatürasyon ve aktivite kaybı meydana gelebilir. Bunun nedeni ise elektrostatik çekimler nedeni ile proteinin üç boyutlu yapısının bozulmasıdır.

4. İyonik Şiddeti Düşürerek Çöktürme

Bazı proteinler çözeltinin iyonik şiddetinin belirli bir değerin altına düşürülmesi ile çöktürülebilir. Bu nadiren uygulanan bir yöntem, ham ekstratların kullanılma durumlarında gerçekleştirilebilir. İyonik kuvvet sadece su ilavesi ile düşürülebilir. Böylece konsantrasyon azalırken genelde çözünürlük artmış olur. Düşük iyonik şiddet ile çöktürme işleminin gerçekleşmesi izoelektrik noktada ya da izoelektronik nokta civarında daha olasıdır.

5. Organik Çözücüler ile Çöktürme

Pek çok protein, aseton veya etanol gibi su ile karışabilen organik çözücülerin eklenmesi yoluyla çöktürülebilir. Burada proteinin çökme davranışı geliştiren faktörler izoelektrik çöktürmedekilere benzerdir ve salting-out etkisi ile çöktürmede olduğundan farklıdır. Bu nedenle, bu yöntem bir saflaştırma prosesinde izoelektrik çöktürmeye alternatif olarak ya da salting-out ile birleştirilerek kullanılabilir. Organik çözücünün ilavesi çözeltinin dielektrik sabitini ve dolayısıyla çözme kuvvetini düşürmektedir. Böylece proteinin çözünürlüğü azaltılmış olur ve elektrostatik çekimler etkisi ile agregasyon meydana gelebilir. Çökme pH değeri proteinin pI değerine yakın olunca daha kolay bir şekilde meydana gelmektedir. Proteinin boyutu da çökme davranışını geliştirmektedir. Buna göre daha büyük proteinler diğer özellikleri aynı olan daha küçük proteinlere göre daha düşük organik çözücü konsantrasyonlarında çökeceklerdir. Bununla birlikte bazı hidrofobik proteinler, özellikle hücre membranlarında bulunanlar organik çözücüler etkisi ile çöktürülemezler ve aslında membranlardan organik çözücü proteinin hidrofobik parçaları etrafındaki su moleküllerinin yerini alacaktır ki bu da çözünürlüğün artması ile sonuçlanacaktır.

Denatürasyonu minimuma indirmek için organik çözücülerle çöktürme işlemi 0°C’de veya altındaki sıcaklıklarda gerçekleştirilmelidir. Daha yüksek sıcaklıklarda protein konformasyonu hızlı bir şekilde değişecektir. Bu da organik çözücü moleküllerinin proteinin iç kısmına erişmesine olanak sağlayacaktır. Burada bu moleküller hidrofobik etkileşimleri bozabilir ve denatürasyona sebep olabilirler. Organik çözücülerin sulu çözeltilerle karışımlarının donma noktasının 0°C’nin altında olması bu çöktürme işleminin uygulanabilirliği açısından şanstır. Aseton ve etanol en çok kullanılan çözücülerdir; kullanılan diğer çözücüler metanol, propan-1-ol ve propan-2-ol’dür. Özellikle büyük ölçeklerde çalışırken güvenlik dikkate alınmalıdır; buna göre çözücü göreceli olarak toksik olmamalı ve görece olarak yüksek parlama noktasına sahip olmalıdır.

6. Organik Polimerler ile Çöktürme

PEG(polietilen glikol) en çok kullanılan organik polimerdir. Çöktürme mekanizması organik çözücülerle çöktürme mekanizması ile benzerdir. Bununla birlikte daha düşük konsantrasyonlar gerektirmektedir, genellikle %20′den daha düşük. Daha yüksek konsantrasyonlar viskoz çözelti oluşumu ile sonuçlanmaktadır. Bu da çökeltinin geri kazanılmasını zorlaştırmaktadır. Polimerin molekül ağırlığı 4000′den daha büyük olmalıdır.

7. Denatürasyon ile Çöktürme

Denatürasyon ile çöktürme eğer ilgilenilen protein muamele sonrasında denatüre olmuyorsa, buna karşılık kontamine edici proteinler denatüre oluyorsa, bir saflaştırma adımı olarak kullanılabilir. Denatürasyon, sıcaklığın, pH’ın değiştirilmesi ya da organik çözücülerin eklenmesi ile gerçekleştirilebilir. Proteinlerin tersiyer yapısı denatürasyon esnasında bozulur. Bunun sonucunda rastgele sarmal yapılar oluşur. Çözelti içerisinde bu sarmallar birbirlerine dolaşırlar ve böylece agregatlar oluştururlar. Agregat oluşumu pH ve iyonik şiddet ile geliştirilebilir. Daha çok düşük iyonik şiddette ve proteinin izoelektrik noktası civarlarında gerçekleşir.

7.1. Yüksek sıcaklık ile denatürasyon

Yüksek sıcaklıklar, proteindeki konformasyonu sağlayan bağları kırarak ve birleşmiş çözücü moleküllerinin serbest kalmasını sağlayarak gerçekleştirmektedir. Farklı proteinler için denatürasyon sıcaklığı da farklıdır.

7.2. pH ile denatürasyon

Aşırı pH iç kısımlarda elektrostatik itmeye neden olmaktadır ya da amino asit yan zincirindeki yükleri değiştirerek iç kısımlardaki elektrostatik çekme kuvvetlerini yok etmektedir. Bunun sonucunda protein açılır.  Ve bağlanmış çözücü molekülleri uzaklaşır. Bu da denatürasyon ile sonuçlanır.

7.3. Organik çözücü ile denatürasyon

Organik çözücüler ile seçici denatürasyon, denatürasyonu arttırmak için, genellikle 20-30 °C’lerde gerçekleştirilir.

8. Proteinleri sülfosalisilik asit ile çöktürme yöntemi

Proteinlerdeki serbest bazik grupların, sülfosalisilik asit ile suda çözünmeyen bileşik oluşturmaları prensibine dayanır. Bir deney tüpüne 1-2 mL seyreltik serum konur. Deney tüpündeki seyreltik serum üzerine 1-2 damla %20’lik sülfosalisilik asit çözeltisi damlatılır. Deney tüpünde beyaz bir bulanıklık oluştuğu gözlenir.

Açıklama:  Serumda bulunan proteinlerdeki serbest amino grupları gibi bazik gruplar, sülfosalisilik asit ile birleşirler ve protein-sülfosalisilik asit bileşiği oluşur. Oluşan protein-sülfosalisilik asit bileşiği suda çözünmediğinden çöker. Deney tüpünde gözlenen bulanıklık, çöken protein-sülfosalisilik asit bileşiğinden ileri gelmektedir.

9. Proteinleri Konsantre Nitrik Asit ile Çöktürme Yöntemi (Heller’in Halka Deneyi)

Proteinlerin, nitrik asit ile asit-metaprotein (asit-albümin) bileşiği oluşturmaları prensibine dayanır. Bir deney tüpüne 1-2 mL konsantre HNO3 konur. Deney tüpündeki konsantre HNO3 üzerine 1 mL seyreltik serum tabakalandırılır. Deney tüpünde HNO3 ve serumun temas yerinde beyaz bir halka oluştuğu gözlenir.

Açıklama: Serumda bulunan proteinler, nitrik asit ile birleşirler ve beyaz renkli asit-metaprotein (asit-albümin) bileşiği oluştururlar. Deney tüpünde gözlenen beyaz halka, asit-metaprotein (asit-albümin) bileşiğinden ileri gelmektedir.

10. Proteinleri Triklorasetik Asit (TCA) ile Çöktürme Yöntemi

Proteinlerin, triklorasetik asit (TCA) anyonları ile bağlanarak suda çözünmeyen tuzlar oluşturmaları prensibine dayanır. Bir deney tüpüne 1-2 mL seyreltik serum konur. Deney tüpündeki seyreltik serum üzerine 1-2 damla %20’lik TCA çözeltisi damlatılır. Deney tüpünde bulanıklık oluştuğu gözlenir.

Açıklama:  Serumda bulunan proteinler, TCA’in anyonları ile bağlanarak suda çözünmeyen tuzlar oluştururlar. Gözlenen bulanıklık, bu tuzların çökmesinden ileri gelmektedir.

11. Proteinleri Kaynatma-Asetik Asitle Çöktürme Yöntemi

Proteinlerin,  ısı etkisiyle denatüre olmaları ve asetik asitin proteinlerin denatürasyonunu artırması prensibine dayanır. Bir deney tüpüne 1-2 mL seyreltik serum konur. Deney tüpü dikkatli bir şekilde ısıtılır. Deney tüpünde beyaz bir bulanıklık oluştuğu gözlenir. Deney tüpündeki bulanıklık üzerine birkaç damla asetik asit damlatılır; bulanıklığın arttığı veya değişmediği gözlenir.

Açıklama: Serumda bulunan proteinler ısı etkisiyle denatüre olurlar ve çözünürlükleri azalır. Deney tüpünde gözlenen bulanıklık, çözünürlükleri azalan proteinlerin çökmesinden ileri gelmektedir. Asetik asit, proteinlerin denatürasyonunu artırır.

 

KAYNAKLAR

[hidepost=0]

Yıldırım, A., Bardakçı, F., Karataş, M., Tanyolaç, B., Moleküler Biyoloji, 2. Baskı, Ekim 2010, Ankara

Tutar, Y., Geçkil, H., Karataş, M., Biyokimya, 3. Baskıdan Çeviri, Şubat 2010, Ankara

Nelson, D. L., Cox, M. M., Lehninger Principles of Biochemistry, Fifth Edition, New York, 2010

www.duzen.com.tr

maycalistaylari.comu.edu.tr[/hidepost]